matricula 88347 En química una dilución es un proceso que reduce la concentración de una sustancia en una solución. Una solución seriada es la dilución repetida de una solución para conseguir una dilución geométrica de la solución original. Frecuentemente se realiza en experimentos que requieran soluciones altamente diluidas con gran exactitud, tales como aquellas que impliquen curvas de concentración en una escala logarítmica. Las diluciones seriadas son altamente usadas en las ciencias experimentales como la bioquímica, microbiología, farmacología y física. Técnicas de aglutinación y precipitación. Se basan en la propiedad de los anticuerpos de tener dos brazos. Unen los antígenos aproximándolos en el espacio, formando complejos insolubles. Dependiendo si es un elemento soluble o particulado, veremos reacciones de precipitación o aglutinación. En una primera fase las moléculas de anticuerpo se van uniendo, y siempre que tengan más de un determinante antigénico igual, se darán estas técnicas. Necesitamos que el antígeno tenga mas de un determinante antigénico igual, para poder ser reconocido por mas de una anticuerpo a la vez, formando redes que sean insolubles, y precipiten en caso de las técnicas de precipitación. La concentración de antígeno y anticuerpo debe ser homogénea, con un poco de exceso de anticuerpo. Si el exceso de anticuerpo es grande, este no formará redes. El momento óptimo estará en proporciones bastantes homogéneas , donde la precipitación será máxima, y se conoce como zona de equivalencia. En excesos de antígeno, los anticuerpos estarán bloqueados y no precipitan. Podemos realizar una curva. La hemaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos. Se trata de una respuesta biológica común frente determinados microorganismos, como los virus, y se emplea rutinariamente en técnicas de tipado de grupos sanguíneos o en la determinación de cargas virales. La hemaglutinación se debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos, antígenos capaces de reaccionar con anticuerpos o bien con proteínas específicas de algunos microorganismos (entre las que destacan las hemaglutininas). Un ejemplo de sus aplicaciones se encuentra en la detección del grupo sanguíneo (sistema ABO). Para ello, se añade un antisuero anti- A, anti-B o anti-AB a sangre tratada con heparina o EDTA tripotasico (dos anticoagulantes). Cuando los glóbulos rojos poseen el antígeno específico para el antisuero empleado, se produce la aglutinación. La fijación del complemento es una técnica de laboratorio específica que busca ver si el cuerpo ha producido anticuerpos para una sustancia extraña específica (antígeno), en este caso Coccidioides immitis. Si hay presencia de anticuerpos, éstos se pegan o "se fijan" al antígeno, razón por la cual el examen se denomina "fijación". Inmunodifusión Técnica para identificación y cuantificación de cualquiera de las inmunoglobulinas. Se basa en la presencia de un precipitado visible, resultado de la combinación antígeno-anticuerpo en determinadas circunstancias. La difusión doble en gel es una técnica que permite identificar anticuerpos en muestras mezcladas. En una placa de agar, cada combinación antígeno-anticuerpo forma una línea separada; la observación de la localización, forma y grosor de la línea permite la identificación y cuantificación del anticuerpo. La difusión en gel es una técnica que implica la evaluación de la reacción de precipitinas en un gel transparente. La inmunoelectrodifusión es una difusión en gel a la que se aplica un campo eléctrico, que acelera la reacción.
matricula 88347 El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del inglés Radioimmunoassay) es un tipo de inmunoensayo o método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa molécula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar que una molécula sea antigénica está basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune. Un coadyuvante muy usado es la albúmina de suero bovino o BSA, por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie aparecerán anticuerpos contra el hapteno. ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
matricula 88347 -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo. En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. FINAL
Definición general de disolución:Una dilución es una mezcla homogénea, uniforme y estable, formada por dos o más sustancias denominadas componentes. La sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El soluto puede ser un gas, un líquido o un sólido, y el disolvente puede ser también un gas, un líquido o un sólido.
Dilucion Seriada- Es un procedimiento que se aplica para diluir la concentración de anticuerpos que se encuentran en una muestra de suero de un paciente. También se interpreta como la máxima cantidad de anticuerpos producidos por el sistema inmune adaptativo (linfocitos B) y que por estar saturada, debe determinarse por medio de las diluciones en igualdad de volumen (suero del paciente + suero fisiológico). El volumen del diluyente (suero fisiológico o agua destilada), lo define el personal del laboratorio, ya que este volumen debe estar relacionado con el volumen de suero con el que se cuente, es decir si utilizamos 1 parte de agua destilada, se deb mezclar con 1 parte de suero del paciente, así el procedimiento es correcto. Nunca debe meclarse volumenes diferentes, porque la dilución dejaría de ser seriada y se comete el error de no saber cual es el título de la dilución. Pruebas de aglutinacion- se basan en los antigenos particulados a los anticuerpos, preferentemente de la clase IgM. Suela tratarse de pruebas muy sensibles pero con muy poca especificidad. Ejemplo de este tipo de prueba es la aglutinacion con rosa de Bengala aplicada en el diagnostico de Brucelosis. Pruebas de precipitacion- Se utilizan antigenos solublesque se difunden frente a los anticuerpos. Permite ver la presencia de anticuerpos especificos. Ejemplo clasico de esta prueba es la inmunodifusion en gel de agar utilizada en el diagnostico de leucosis bovina. La fijacion de complemento- Se basa en la capacidad del complemento de unirse a los complejo Antigeno-Anticuerpo. La prueba incluye la adicion de eritrocitos sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee anticuerpos especificos, se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina para lisar los eritrocitos. Prueba muy especifica. Hemaglutinacion-Se utiliza con patogenos que poseen esta capacidad, generalmente virus. El ejemplo mas clasico es el diagnostico de la influenza. Inmunoflourescencia- Las pruebas de inmunoflourescencia pueden utilizarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un patogeno. En ambos casos, la reaccion finaliza mediante la adicion de un anticuerpo conjugado a una sustancia flourescente, habitualmente flouresceina. Estas pruebas son muy sensibles pero su interpretacion tiene alto grado de subjetividad. ELISA- Las pruebas inmunoenzimaticas se basan en una reaccion antigeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte solido (microplaca de plastico) a la que se ha adsorbido un antigeno o anticuerpo. La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccion final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Son pruebas muy sensibles y especificas. Radioinmunoensayo-método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Matrícula: 2012-0273 Diluciones Seriadas, Diluciones Combinadas y microdiluciones Una dilución en serie es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia en disolución. Por lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que da como resultado una progresión geométrica de la concentración, en forma logarítmica. Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones muy diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretenda estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica. Las diluciones en serie son ampliamente utilizadas en las ciencias experimentales, incluyendo bioquímica, química, farmacología, microbiología y física, así como en la homeopatía. Una dilución decimal es llamada dilución logarítmica o log-dilución. En cada etapa, se toma una parte de la disolución anterior y se le añaden nueve volúmenes de agua. Una dilución en serie de este tipo, podría hacer que las concentraciones sucesivas fuesen 1 M; 0,1 M; 0,01 M; 0,001 M, y así sucesivamente. Una dilución al doble de volumen (dilución doble) se denomina a veces dilución semilogarítmica o dilución en factor de 2. Una dilución al cuádruple de volumen se denomina dilución cuarto-logarítmica o dilución cuarto-log. El objetivo de las diluciones combinadas es acortar el hiato o la distancia entre una dilución seriada y la siguiente dando una cualificación más precisa del título serológico. El título serológico es la máxima dilución del suero donde se observe la reacción positiva. Toda prueba serológica conlleva controles positivos y negativos. El control negativo se efectúa con un suero conocido sin los anticuerpos buscados. Actualmente las pruebas serológicas se realizan en Sistema de Microtécnica mediante placas de acrílico u otro plástico inerte. Estas placas poseen 96 hoyuelos, los cuales sustituyen a un numero idéntico de tubos. Estos hoyuelos tienen una capacidad limitada por lo que las diluciones deben hacerse empleando mínimas cantidades de suero reactivos (en décimas o milésimas de mls).
Matrícula: 2012-0273 Aglutinación y precipitación La aglutinación precipita células enteras mientras que en la precipitación se precipitan proteínas. En la aglutinación una célula entera con determinantes antigénicos en presencia de una aglutinina forma un agregado que precipita (las aglutininas son Ac). Como los Ag son iguales, se unen y forman una red que precipita. Los test se hacen en portas en donde se pone Ac, si aparecen grumos es porque existe el Ag. Son los tests que se hacen para conocer el grupo sanguíneo. Otras veces se hacen diluciones seriadas del Ag, se hace una titulación, y se añade igual cantidad de Ac, se ve qué volumen mínimo produce grumos. La aglutinación viral es la aglutinación de glóbulos rojos, es una propiedad de determinados virus, si existe aglutinación existen virus. En la precipitación el determinante antigénico o precipitógeno se une al Ac o precipitina y dan un compuesto que precipita. En un tubo se pone una dilución con suero y se ve si existe precipitado. Si existe exceso de Ac o de Ag el precipitado no se ve. Para que dé positivo tiene que existir un equilibrio, es el punto en el que las concentraciones de Ag y Ac son iguales. Test de difusión en agar o geles: es la inmunodifusión. Ambas soluciones difunden desde los agujeros. Cuando existe identidad Ag-Ac se forma una banda. (fotocopias). Inmuinoelectroforesis: se separan las proteínas en un suero a través de un campo eléctrico. En otro pocillo se pone el antisuero y se deja migrar hacia las proteínas se ven Ig y albúminas al aparecer arcos por precipitación sobre el gel de electroforesis. Inmunoblot o western blot por electroforesis se separan las proteínas, se ponen en una membrana y se les aplica un campo eléctrico, se les añade la solución con el Ac contra el Ag. El Ac se une al Ag si está en la membrana. Se ve esta unión con otro Ac conjugado a un isótopo radiactivo o a una enzima que da una reacción coloreada. Radioinmunoanálisis (RIA) y enzimoinmunoanálisis (ELISA). Se aumenta la sensibilidad de la unión con la conjugación de Ac con isótopos (RIS) o enzimas (ELISA), en este caso pueden ser la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. Existen dos tipos de ELISA el directo y el indirecto. El directo detecta la existencia de Ag en el suero, mientras que el indirecto lo que detecta es el AC, estos últimos son los más comunes (HIV, Richtsias, vibrio,etc.). (fotocopias). En el indirecto se pone un segundo Ac que une la enzima, este Ac 2º de revelado pone de relieve la existencia de un Ac 1º y por tanto la existencia del Ag. Al añadir el sustrato de la enzima se produce una reacción enzimática que da color si la reacción es positiva. Inmunofluorescencia: Los Ac están conjugados a fluorocormos como la fluoresceína o la rodamina que emiten luz visible cuando se irradian con UV. Puede ser directo cuando usando el Ag desconocido se ensaya con Ac fluorescente, pero puede ser indirecto si usando Ac desconocido se ensaya con un Ag conocido, aquí existe reacción positiva cuando el 2º Ac que es fluorescente se une al 1º. La base es semejante al ELISA. (Ej. diagnóstico de sífilis).
Matrícula: 2012-0273 Hemaglutinación La hemaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos. Se trata de una respuesta biológica común frente determinados microorganismos, como los virus, y se emplea rutinariamente en técnicas de tipado de grupos sanguíneos o en la determinación de cargas virales. La hemaglutinación se debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos, antígenos capaces de reaccionar con anticuerpos o bien con proteínas específicas de algunos microorganismos (entre las que destacan las hemaglutininas). Un ejemplo de sus aplicaciones se encuentra en la detección del grupo sanguíneo (sistema ABO). Para ello, se añade un antisuero anti- A, anti-B o anti-AB a sangre tratada con heparina o EDTA tripotasico (dos anticoagulantes). Cuando los glóbulos rojos poseen el antígeno específico para el antisuero empleado, se produce la aglutinación. Anticuerpos bloquiadores Durante una respuesta inmune ocurren cambios en la cantidad y calidad de los anticuerpos que se sintetizan. Estos anticuerpos son de la clase IgG, actúan como bloqueantes, univalentes, incapaces de formar complejos adecuados para la activación de los mecanismos biológicos que llevan al daño del agente agresor. Tienen dos paratopes, uno de los cuales es de muy baja afinidad para el antígeno, lo que es consecuencia de un impedimento estérico originado por un hidrato de carbono del tipo high mannose, que determina la asimetría funcional, haciendo que se comporten como univalentes. Cuando los anticuerpos asimétricos tienen especificidad para antígenos propios son beneficiosos para el huésped, participando en los mecanismos de la tolerancia, siendo perjudiciales cuando los antígenos son extraños, como ocurre en las infecciones microbianas crónicas. Los anticuerpos asimétricos cumplen una función beneficiosa durante la preñez, no obstante de que los antígenos fetales de origen paterno, responsables del proceso son extraños para el huésped. La placenta secreta factores (moléculas) que regulan la síntesis de éstos anticuerpos, favoreciendo por éste mecanismo la sobrevida del feto en el útero materno. Fijacion del complemento La fijación del complemento es una técnica de laboratorio específica que busca ver si el cuerpo ha producido anticuerpos para una sustancia extraña específica (antígeno), en este caso Coccidioides immitis. Si hay presencia de anticuerpos, éstos se pegan o "se fijan" al antígeno, razón por la cual el examen se denomina "fijación". El líquido cefalorraquídeo que se necesita para realizar este examen generalmente se obtiene a través de unapunción lumbar (punción raquídea).
Matrícula: 2012-0273 Inmunodifusión La inmunodifusión radial es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos IgG, IgM e IgA que hay en el suero de un individuo. La técnica de inmunodifusión radial es lenta y poco sensible ya que necesita mucha cantidad de anticuerpos (o antígeno) para que se formen complejos. El antígeno en suspensión se mezcla con agar-agar en estado líquido y luego éste se vierte sobre una placa (generalmente un portaobjetos de microscopía). Una vez solidificado, con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) que contendrán la muestra de suero. Se deja incubar de modo que el suero con anticuerpos se difunde por la placa de agar y reacciona con el antígeno embebido en la placa. Al cabo de 24 horas se ha creado un precipitado fruto de la reacción entre antígeno y anticuerpo que se muestra en la placa como una línea blanca rodeando al pocillo (en ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar su visionado). El diámetro de este círculo es un reflejo de la concentración de anticuerpos que teníamos en la muestra de suero, de modo que a mayor diámetro, mayor concentración de anticuerpo. Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de una recta estándar o patrón previamente creada. Esta recta se hace a partir de muestras de anticuerpos conocidas en cada pocillo, que reaccionan con el antígeno; en el eje x el área del círculo y en el eje y la concentración de anticuerpos conocida. Al final se comparan los valores obtenidos de la muestra de suero frente a los valores de la recta patrón, obteniendo así el valor de la concentración de anticuerpos para cada muestra de suero del individuo. Del mismo modo, se puede calcular mediante una metodología análoga la cantidad de antígeno presente en una muestra, embebiendo esta vez en agar anticuerpo y creando la recta patrón en base a concentraciones conocidas de antígeno. y también se une a la inmunoglobulina M.
Matrícula: 2012-0273 Dobleinmunodifusión La inmunodifusión doble de Ouchterlony es un método inmunológico sencillo y rutinariamente usado en el laboratorio clínico para la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica. Es considerado el proceso estándar para la detección de Antígenos Nucleares Extraibles (ENA). Sobre una placa con gel se corta una serie de hoyos con atención a la geometría entre un hoyo y los demás. Se coloca un extracto de células humanas (extraídas de tejido de las amígdalas) en el pocillo del centro. Este extracto contiene un cóctel de antígenos humanos naturales que se quiere obtener. El suero sanguíneo del paciente es colocado luego en uno de los pocillos exteriores y la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo, los antígenos de las amígdalas y los anticuerpos en el pocillo del suero migrarán de manera radial hacia afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en contra de los antígenos tonsilares, se unirán en una red de enlaces llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una línea blanquecina. La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos, debido a que éstos tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antigénicos pormolécula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez, tiene por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, de modo que se entrecruzan formando una gran matriz de agregados antígeno:anticuerpo. Experimentalmente, una cantidad de antígeno se añade de manera incrementada a una cantidad constante de anticuerpo en solución. Inicialmente, a una baja concentración, todo el antígeno participa en el precipitado, lo cual se conoce como una zona de exceso de anticuerpo o fenómeno de prozona. A medida que se añade más antígeno, la cantidad de proteína que precipita, aumenta hasta que las moléculas de antígeno:anticuerpo alcanzan una proporción óptima, llamada zona de equivalencia. La zona de exceso se logra cuando la concentración del antígeno excede a la de los anticuerpos, y la cantidad de precipitación disminuye.
Contrainmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es el nombre genérico que reciben un amplio número de métodos bioquímicos para la separación y caracterización de proteínas basadas en la electroforesis y la reacción con anticuerpos. Todas las variantes de la inmunoelectroforesis requieren inmunoglobulinas, anticuerpos que van a reaccionar con las proteínas que se desea separar o caracterizar. Los métodos fueron desarrollados y usados ampliamente durante la segunda mitad del Siglo XX. Se suele utilizar un gel de agarosa al 1% con un grosor cercano al milímetro, y un pH en torno al 8,6. Esto sirve tanto para la electroforesis como para la reacción con los anticuerpos. Se prefiere la agarosa como matriz de soporte porque tiene un tamaño de poro mayor que otros medios, que permiten el libre paso y separación de las proteínas, pero en cambio es lo suficientemente estrecho como para impedir el paso de los complejos antígeno-anticuerpo. El elevado pH se utiliza porque, en esas condiciones, los anticuerpos son prácticamente inmóviles. Se suele emplear una bañera de electroforesis de tipo horizontal. Los complejos de inmunoprecipitación se pueden ver en el mismo gel de agarosa, pero requieren ser teñidos con colorantes para proteínas tales como el Azul Coomassie. En contraste con laelectroforesis en gel SDS, la electroforesis en gel de argarosa permite que las proteínas estén en forma nativa (estructura cuaternaria), por lo que la inmunoelectroforesis permite la caracterización de la actividad enzimática y la unión a ligandos además de la separación electroforética. La contrainmunoelectroforesis consiste en el aprovechamiento de la distinta movilidad electroforética de los dos componentes implicados. Dado que las inmunoglobulinas migran hacia el polo negativo y las proteínas, dada su carga neta negativa, lo hacen hacia el positivo, se colocan de forma inversa a su migración, forzando así su encuentro. Es decir, cerca del polo positivo colocaremos el suero con los anticuerpos que irán contra nuestro antígeno, migrando estos hacia el polo negativo, mientras que cerca del polo negativo se cargarán los antígenos de interés, a sabiendas de que migrarán hacia el polo positivo. De este modo, ambos se encontrarán (según su movilidad electroforética) a una distancia intermedia, asegurando así la interacción.
Radioinmunoensayo El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del inglés Radioimmunoassay) es un tipo de inmunoensayo o método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejosAntígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa molécula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar que una molécula sea antigénica está basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune. Uncoadyuvante muy usado es la albúmina de suero bovino o BSA, por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie aparecerán anticuerpos contra el hapteno.
Matrícula: 2012-0273 ELISA ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer: -En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo. -En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña. -En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo. En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
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ResponderEliminarEn química una dilución es un proceso que reduce la concentración de una sustancia en una solución. Una solución seriada es la dilución repetida de una solución para conseguir una dilución geométrica de la solución original. Frecuentemente se realiza en experimentos que requieran soluciones altamente diluidas con gran exactitud, tales como aquellas que impliquen curvas de concentración en una escala logarítmica. Las diluciones seriadas son altamente usadas en las ciencias experimentales como la bioquímica, microbiología, farmacología y física.
Técnicas de aglutinación y precipitación.
Se basan en la propiedad de los anticuerpos de tener dos brazos. Unen los antígenos aproximándolos en el espacio, formando complejos insolubles. Dependiendo si es un elemento soluble o particulado, veremos reacciones de precipitación o aglutinación. En una primera fase las moléculas de anticuerpo se van uniendo, y siempre que tengan más de un determinante antigénico igual, se darán estas técnicas. Necesitamos que el antígeno tenga mas de un determinante antigénico igual, para poder ser reconocido por mas de una anticuerpo a la vez, formando redes que sean insolubles, y precipiten en caso de las técnicas de precipitación. La concentración de antígeno y anticuerpo debe ser homogénea, con un poco de exceso de anticuerpo. Si el exceso de anticuerpo es grande, este no formará redes. El momento óptimo estará en proporciones bastantes homogéneas , donde la precipitación será máxima, y se conoce como zona de equivalencia. En excesos de antígeno, los anticuerpos estarán bloqueados y no precipitan. Podemos realizar una curva.
La hemaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos. Se trata de una respuesta biológica común frente determinados microorganismos, como los virus, y se emplea rutinariamente en técnicas de tipado de grupos sanguíneos o en la determinación de cargas virales. La hemaglutinación se debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos, antígenos capaces de reaccionar con anticuerpos o bien con proteínas específicas de algunos microorganismos (entre las que destacan las hemaglutininas). Un ejemplo de sus aplicaciones se encuentra en la detección del grupo sanguíneo (sistema ABO). Para ello, se añade un antisuero anti- A, anti-B o anti-AB a sangre tratada con heparina o EDTA tripotasico (dos anticoagulantes). Cuando los glóbulos rojos poseen el antígeno específico para el antisuero empleado, se produce la aglutinación.
La fijación del complemento es una técnica de laboratorio específica que busca ver si el cuerpo ha producido anticuerpos para una sustancia extraña específica (antígeno), en este caso Coccidioides immitis. Si hay presencia de anticuerpos, éstos se pegan o "se fijan" al antígeno, razón por la cual el examen se denomina "fijación".
Inmunodifusión
Técnica para identificación y cuantificación de cualquiera de las inmunoglobulinas. Se basa en la presencia de un precipitado visible, resultado de la combinación antígeno-anticuerpo en determinadas circunstancias. La difusión doble en gel es una técnica que permite identificar anticuerpos en muestras mezcladas. En una placa de agar, cada combinación antígeno-anticuerpo forma una línea separada; la observación de la localización, forma y grosor de la línea permite la identificación y cuantificación del anticuerpo. La difusión en gel es una técnica que implica la evaluación de la reacción de precipitinas en un gel transparente. La inmunoelectrodifusión es una difusión en gel a la que se aplica un campo eléctrico, que acelera la reacción.
matricula 88347
ResponderEliminarEl Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del inglés Radioimmunoassay) es un tipo de inmunoensayo o método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa molécula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar que una molécula sea antigénica está basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune. Un coadyuvante muy usado es la albúmina de suero bovino o BSA, por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie aparecerán anticuerpos contra el hapteno.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
matricula 88347
ResponderEliminar-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
FINAL
Grisselle M. Robaina 88585
ResponderEliminarDiluciones
Definición general de disolución:Una dilución es una mezcla homogénea, uniforme y estable, formada por dos o más sustancias denominadas componentes. La sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta. El soluto puede ser un gas, un líquido o un sólido, y el disolvente puede ser también un gas, un líquido o un sólido.
Dilucion Seriada- Es un procedimiento que se aplica para diluir la concentración de anticuerpos que se encuentran en una muestra de suero de un paciente. También se interpreta como la máxima cantidad de anticuerpos producidos por el sistema inmune adaptativo (linfocitos B) y que por estar saturada, debe determinarse por medio de las diluciones en igualdad de volumen (suero del paciente + suero fisiológico). El volumen del diluyente (suero fisiológico o agua destilada), lo define el personal del laboratorio, ya que este volumen debe estar relacionado con el volumen de suero con el que se cuente, es decir si utilizamos 1 parte de agua destilada, se deb mezclar con 1 parte de suero del paciente, así el procedimiento es correcto. Nunca debe meclarse volumenes diferentes, porque la dilución dejaría de ser seriada y se comete el error de no saber cual es el título de la dilución.
Pruebas de aglutinacion- se basan en los antigenos particulados a los anticuerpos, preferentemente de la clase IgM. Suela tratarse de pruebas muy sensibles pero con muy poca especificidad. Ejemplo de este tipo de prueba es la aglutinacion con rosa de Bengala aplicada en el diagnostico de Brucelosis.
Pruebas de precipitacion- Se utilizan antigenos solublesque se difunden frente a los anticuerpos. Permite ver la presencia de anticuerpos especificos. Ejemplo clasico de esta prueba es la inmunodifusion en gel de agar utilizada en el diagnostico de leucosis bovina.
La fijacion de complemento- Se basa en la capacidad del complemento de unirse a los complejo Antigeno-Anticuerpo. La prueba incluye la adicion de eritrocitos sensibilizados con una hemolisina. Si el suero posee anticuerpos especificos, se fija el complemento y no puede unirse a la hemolisina para lisar los eritrocitos. Prueba muy especifica.
Hemaglutinacion-Se utiliza con patogenos que poseen esta capacidad, generalmente virus. El ejemplo mas clasico es el diagnostico de la influenza.
Inmunoflourescencia- Las pruebas de inmunoflourescencia pueden utilizarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un patogeno. En ambos casos, la reaccion finaliza mediante la adicion de un anticuerpo conjugado a una sustancia flourescente, habitualmente flouresceina. Estas pruebas son muy sensibles pero su interpretacion tiene alto grado de subjetividad.
ELISA- Las pruebas inmunoenzimaticas se basan en una reaccion antigeno anticuerpo que tiene lugar sobre un soporte solido (microplaca de plastico) a la que se ha adsorbido un antigeno o anticuerpo. La prueba puede desarrollarse en diferentes modalidades pero en todas ellas la reaccion final se revela mediante un enzima que modifica un substrato que adquiere color. Son pruebas muy sensibles y especificas.
Radioinmunoensayo-método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejos Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías.
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
ResponderEliminarSe usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarDiluciones Seriadas, Diluciones Combinadas y microdiluciones
Una dilución en serie es la reducción progresiva, paso a paso, de la concentración de una sustancia en disolución. Por lo general, el factor de dilución en cada paso es constante, lo que da como resultado una progresión geométrica de la concentración, en forma logarítmica. Las diluciones en serie se utilizan para crear disoluciones muy diluidas con precisión, así como disoluciones para experimentos en los que se pretenda estudiar curvas de concentración con una escala logarítmica. Las diluciones en serie son ampliamente utilizadas en las ciencias experimentales, incluyendo bioquímica, química, farmacología, microbiología y física, así como en la homeopatía.
Una dilución decimal es llamada dilución logarítmica o log-dilución. En cada etapa, se toma una parte de la disolución anterior y se le añaden nueve volúmenes de agua. Una dilución en serie de este tipo, podría hacer que las concentraciones sucesivas fuesen 1 M; 0,1 M; 0,01 M; 0,001 M, y así sucesivamente. Una dilución al doble de volumen (dilución doble) se denomina a veces dilución semilogarítmica o dilución en factor de 2. Una dilución al cuádruple de volumen se denomina dilución cuarto-logarítmica o dilución cuarto-log.
El objetivo de las diluciones combinadas es acortar el hiato o la distancia entre una dilución seriada y la siguiente dando una cualificación más precisa del título serológico. El título serológico es la máxima dilución del suero donde se observe la reacción positiva. Toda prueba serológica conlleva controles positivos y negativos. El control negativo se efectúa con un suero conocido sin los anticuerpos buscados.
Actualmente las pruebas serológicas se realizan en Sistema de Microtécnica mediante placas de acrílico u otro plástico inerte. Estas placas poseen 96 hoyuelos, los cuales sustituyen a un numero idéntico de tubos. Estos hoyuelos tienen una capacidad limitada por lo que las diluciones deben hacerse empleando mínimas cantidades de suero reactivos (en décimas o milésimas de mls).
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarAglutinación y precipitación
La aglutinación precipita células enteras mientras que en la precipitación se precipitan proteínas.
En la aglutinación una célula entera con determinantes antigénicos en presencia de una aglutinina forma un agregado que precipita (las aglutininas son Ac). Como los Ag son iguales, se unen y forman una red que precipita. Los test se hacen en portas en donde se pone Ac, si aparecen grumos es porque existe el Ag. Son los tests que se hacen para conocer el grupo sanguíneo. Otras veces se hacen diluciones seriadas del Ag, se hace una titulación, y se añade igual cantidad de Ac, se ve qué volumen mínimo produce grumos. La aglutinación viral es la aglutinación de glóbulos rojos, es una propiedad de determinados virus, si existe aglutinación existen virus.
En la precipitación el determinante antigénico o precipitógeno se une al Ac o precipitina y dan un compuesto que precipita. En un tubo se pone una dilución con suero y se ve si existe precipitado. Si existe exceso de Ac o de Ag el precipitado no se ve. Para que dé positivo tiene que existir un equilibrio, es el punto en el que las concentraciones de Ag y Ac son iguales. Test de difusión en agar o geles: es la inmunodifusión. Ambas soluciones difunden desde los agujeros. Cuando existe identidad Ag-Ac se forma una banda. (fotocopias). Inmuinoelectroforesis: se separan las proteínas en un suero a través de un campo eléctrico. En otro pocillo se pone el antisuero y se deja migrar hacia las proteínas se ven Ig y albúminas al aparecer arcos por precipitación sobre el gel de electroforesis.
Inmunoblot o western blot por electroforesis se separan las proteínas, se ponen en una membrana y se les aplica un campo eléctrico, se les añade la solución con el Ac contra el Ag. El Ac se une al Ag si está en la membrana. Se ve esta unión con otro Ac conjugado a un isótopo radiactivo o a una enzima que da una reacción coloreada. Radioinmunoanálisis (RIA) y enzimoinmunoanálisis (ELISA).
Se aumenta la sensibilidad de la unión con la conjugación de Ac con isótopos (RIS) o enzimas (ELISA), en este caso pueden ser la peroxidasa o la fosfatasa alcalina.
Existen dos tipos de ELISA el directo y el indirecto. El directo detecta la existencia de Ag en el suero, mientras que el indirecto lo que detecta es el AC, estos últimos son los más comunes (HIV, Richtsias, vibrio,etc.). (fotocopias). En el indirecto se pone un segundo Ac que une la enzima, este Ac 2º de revelado pone de relieve la existencia de un Ac 1º y por tanto la existencia del Ag. Al añadir el sustrato de la enzima se produce una reacción enzimática que da color si la reacción es positiva.
Inmunofluorescencia: Los Ac están conjugados a fluorocormos como la fluoresceína o la rodamina que emiten luz visible cuando se irradian con UV. Puede ser directo cuando usando el Ag desconocido se ensaya con Ac fluorescente, pero puede ser indirecto si usando Ac desconocido se ensaya con un Ag conocido, aquí existe reacción positiva cuando el 2º Ac que es fluorescente se une al 1º. La base es semejante al ELISA. (Ej. diagnóstico de sífilis).
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarHemaglutinación
La hemaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos. Se trata de una respuesta biológica común frente determinados microorganismos, como los virus, y se emplea rutinariamente en técnicas de tipado de grupos sanguíneos o en la determinación de cargas virales. La hemaglutinación se debe a la presencia de antígenos en los eritrocitos, antígenos capaces de reaccionar con anticuerpos o bien con proteínas específicas de algunos microorganismos (entre las que destacan las hemaglutininas).
Un ejemplo de sus aplicaciones se encuentra en la detección del grupo sanguíneo (sistema ABO). Para ello, se añade un antisuero anti- A, anti-B o anti-AB a sangre tratada con heparina o EDTA tripotasico (dos anticoagulantes). Cuando los glóbulos rojos poseen el antígeno específico para el antisuero empleado, se produce la aglutinación.
Anticuerpos bloquiadores
Durante una respuesta inmune ocurren cambios en la cantidad y calidad de los anticuerpos que se sintetizan. Estos anticuerpos son de la clase IgG, actúan como bloqueantes, univalentes, incapaces de formar complejos adecuados para la activación de los mecanismos biológicos que llevan al daño del agente agresor. Tienen dos paratopes, uno de los cuales es de muy baja afinidad para el antígeno, lo que es consecuencia de un impedimento estérico originado por un hidrato de carbono del tipo high mannose, que determina la asimetría funcional, haciendo que se comporten como univalentes. Cuando los anticuerpos asimétricos tienen especificidad para antígenos propios son beneficiosos para el huésped, participando en los mecanismos de la tolerancia, siendo perjudiciales cuando los antígenos son extraños, como ocurre en las infecciones microbianas crónicas. Los anticuerpos asimétricos cumplen una función beneficiosa durante la preñez, no obstante de que los antígenos fetales de origen paterno, responsables del proceso son extraños para el huésped. La placenta secreta factores (moléculas) que regulan la síntesis de éstos anticuerpos, favoreciendo por éste mecanismo la sobrevida del feto en el útero materno.
Fijacion del complemento
La fijación del complemento es una técnica de laboratorio específica que busca ver si el cuerpo ha producido anticuerpos para una sustancia extraña específica (antígeno), en este caso Coccidioides immitis. Si hay presencia de anticuerpos, éstos se pegan o "se fijan" al antígeno, razón por la cual el examen se denomina "fijación".
El líquido cefalorraquídeo que se necesita para realizar este examen generalmente se obtiene a través de unapunción lumbar (punción raquídea).
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarInmunodifusión
La inmunodifusión radial es una técnica de análisis inmunológico de tipo cuantitativo. Se utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos IgG, IgM e IgA que hay en el suero de un individuo.
La técnica de inmunodifusión radial es lenta y poco sensible ya que necesita mucha cantidad de anticuerpos (o antígeno) para que se formen complejos.
El antígeno en suspensión se mezcla con agar-agar en estado líquido y luego éste se vierte sobre una placa (generalmente un portaobjetos de microscopía). Una vez solidificado, con una pipeta Pasteur se hacen agujeros (pocillos) que contendrán la muestra de suero. Se deja incubar de modo que el suero con anticuerpos se difunde por la placa de agar y reacciona con el antígeno embebido en la placa. Al cabo de 24 horas se ha creado un precipitado fruto de la reacción entre antígeno y anticuerpo que se muestra en la placa como una línea blanca rodeando al pocillo (en ocasiones se pueden aplicar tintes para facilitar su visionado). El diámetro de este círculo es un reflejo de la concentración de anticuerpos que teníamos en la muestra de suero, de modo que a mayor diámetro, mayor concentración de anticuerpo.
Para cuantificar la cantidad exacta de anticuerpos es preciso disponer de una recta estándar o patrón previamente creada. Esta recta se hace a partir de muestras de anticuerpos conocidas en cada pocillo, que reaccionan con el antígeno; en el eje x el área del círculo y en el eje y la concentración de anticuerpos conocida. Al final se comparan los valores obtenidos de la muestra de suero frente a los valores de la recta patrón, obteniendo así el valor de la concentración de anticuerpos para cada muestra de suero del individuo.
Del mismo modo, se puede calcular mediante una metodología análoga la cantidad de antígeno presente en una muestra, embebiendo esta vez en agar anticuerpo y creando la recta patrón en base a concentraciones conocidas de antígeno. y también se une a la inmunoglobulina M.
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarDobleinmunodifusión
La inmunodifusión doble de Ouchterlony es un método inmunológico sencillo y rutinariamente usado en el laboratorio clínico para la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra biológica. Es considerado el proceso estándar para la detección de Antígenos Nucleares Extraibles (ENA).
Sobre una placa con gel se corta una serie de hoyos con atención a la geometría entre un hoyo y los demás. Se coloca un extracto de células humanas (extraídas de tejido de las amígdalas) en el pocillo del centro. Este extracto contiene un cóctel de antígenos humanos naturales que se quiere obtener. El suero sanguíneo del paciente es colocado luego en uno de los pocillos exteriores y la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo, los antígenos de las amígdalas y los anticuerpos en el pocillo del suero migrarán de manera radial hacia afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en contra de los antígenos tonsilares, se unirán en una red de enlaces llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una línea blanquecina.
La precipitación ocurre con la mayoría de los antígenos, debido a que éstos tienden a ser multivalente, es decir, tienen varios determinantes antigénicos pormolécula, al que los anticuerpos pueden enlazarse. Cada anticuerpo, a su vez, tiene por lo menos dos sitios de unión para los antígenos, de modo que se entrecruzan formando una gran matriz de agregados antígeno:anticuerpo.
Experimentalmente, una cantidad de antígeno se añade de manera incrementada a una cantidad constante de anticuerpo en solución. Inicialmente, a una baja concentración, todo el antígeno participa en el precipitado, lo cual se conoce como una zona de exceso de anticuerpo o fenómeno de prozona.
A medida que se añade más antígeno, la cantidad de proteína que precipita, aumenta hasta que las moléculas de antígeno:anticuerpo alcanzan una proporción óptima, llamada zona de equivalencia.
La zona de exceso se logra cuando la concentración del antígeno excede a la de los anticuerpos, y la cantidad de precipitación disminuye.
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarContrainmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis es el nombre genérico que reciben un amplio número de métodos bioquímicos para la separación y caracterización de proteínas basadas en la electroforesis y la reacción con anticuerpos. Todas las variantes de la inmunoelectroforesis requieren inmunoglobulinas, anticuerpos que van a reaccionar con las proteínas que se desea separar o caracterizar. Los métodos fueron desarrollados y usados ampliamente durante la segunda mitad del Siglo XX.
Se suele utilizar un gel de agarosa al 1% con un grosor cercano al milímetro, y un pH en torno al 8,6. Esto sirve tanto para la electroforesis como para la reacción con los anticuerpos. Se prefiere la agarosa como matriz de soporte porque tiene un tamaño de poro mayor que otros medios, que permiten el libre paso y separación de las proteínas, pero en cambio es lo suficientemente estrecho como para impedir el paso de los complejos antígeno-anticuerpo. El elevado pH se utiliza porque, en esas condiciones, los anticuerpos son prácticamente inmóviles. Se suele emplear una bañera de electroforesis de tipo horizontal.
Los complejos de inmunoprecipitación se pueden ver en el mismo gel de agarosa, pero requieren ser teñidos con colorantes para proteínas tales como el Azul Coomassie. En contraste con laelectroforesis en gel SDS, la electroforesis en gel de argarosa permite que las proteínas estén en forma nativa (estructura cuaternaria), por lo que la inmunoelectroforesis permite la caracterización de la actividad enzimática y la unión a ligandos además de la separación electroforética.
La contrainmunoelectroforesis consiste en el aprovechamiento de la distinta movilidad electroforética de los dos componentes implicados. Dado que las inmunoglobulinas migran hacia el polo negativo y las proteínas, dada su carga neta negativa, lo hacen hacia el positivo, se colocan de forma inversa a su migración, forzando así su encuentro. Es decir, cerca del polo positivo colocaremos el suero con los anticuerpos que irán contra nuestro antígeno, migrando estos hacia el polo negativo, mientras que cerca del polo negativo se cargarán los antígenos de interés, a sabiendas de que migrarán hacia el polo positivo. De este modo, ambos se encontrarán (según su movilidad electroforética) a una distancia intermedia, asegurando así la interacción.
Radioinmunoensayo
El Radioinmunoensayo (o abreviado RIA del inglés Radioimmunoassay) es un tipo de inmunoensayo o método radioinmunométrico que se basa en la formación específica de los complejosAntígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) lo que le dota de una gran especificidad unido a la sensibilidad de los métodos radiológicos. La técnica ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías. Casi todas las moléculas pueden ser antigénicas y esto se usa para que los anticuerpos puedan unirse a esa molécula y marcarla radiactivamente. Una buena manera de provocar que una molécula sea antigénica está basada en que un hapteno combinado con un coadyugante da respuesta inmune. Uncoadyuvante muy usado es la albúmina de suero bovino o BSA, por lo que al conjugar un hapteno con BSA e introducirlo en otra especie aparecerán anticuerpos contra el hapteno.
Matrícula: 2012-0273
ResponderEliminarELISA
ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como seleción de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
-En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y que ya se ha recuperado, puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría un falso positivo.
-En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que éstos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.
-En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquél de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población, es decir, que esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población, es necesario volver a confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Entonces es cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.